Elle est la première enfant de Philippe le Beau (voir l'image) et de Jeanne la Folle (voir l'image). Elle est la sœur aînée de Charles Quint. Son grand-père n'est autre que Maximilien d'Autriche qui est aussi son parrain. Marguerite d'York (veuve de Charles le Téméraire) est sa marraine. A la mort de Philippe le Beau, Eléonore et ses frères et sœurs (exceptée sa plus jeune sœur Catherine séquestrée par sa mère) sont recueillis par Marguerite d'Autriche, leur tante, et passeront leur enfance aux Pays Bas. Elle porte aussi le nom de Eléonore d'Autriche, titre donné par le rang de son grand-père mais elle n'ira jamais dans ce pays.

A l'âge de 18 ans, Eléonore s'éprend d'un jeune homme, le prince Palatin Frédéric, quatrième fils de l'Électeur Philippe de Bavière. Celui-ci, sans le sou, réussira tout de même à entrer au service de Philippe le Beau et à représenter Maximilien d'Autriche aux Pays Bas et cela même après la mort du père d'Eléonore. Il sera même décoré de l'ordre de la Toison d'Or.

Mais il ne sera jamais assez bien pour Eléonore aux yeux de son frère. C'est pourquoi il mettra tout en oeuvre pour faire cesser leur relation. Le prince Palatin  retourna alors en Allemagne selon les ordres de Charles Quint. Il gardera néanmoins toujours un bon rapport avec l'Empereur (Charles Quint).

Dès lors, Charles Quint  n'eut qu'une idée en tête, marier sa sœur aînée. Plusieurs partis acceptables lui vint à l'esprit : les rois de Pologne, de France et d'Angleterre. En 1517, Charles Quint promet sa sœur à Manuel 1er, roi du Portugal.

Son futur époux étant pourtant âgé de 48 ans, laid et à moitié handicapé, elle accepte de l'épouser. Ce sera chose faite le 13 juillet 1518. Elle l'épouse par procuration sans jamais l'avoir vu ! Le mariage religieux eut lieu à Lisbonne et fit d'elle reine de Portugal. De ce mariage, elle eut deux enfants : un fils - qui mourut très jeune - et une fille, Maria. Trois ans plus tard, elle tombe veuve. Sa fille lui est enlevée par sa belle-famille.

En 1530, elle épouse François 1er (voir l'image) en seconde noces. Ce n'était pas un mariage d'amour réciproque mais plutôt un gage de paix - quoique éphémère - entre les deux souverains. Eléonore, elle, pourtant aimera son époux qui ne lui porte aucune attention. Le roi n'hésite pas à s'afficher avec sa maîtresse, la duchesse d'Étampes.

En revenant de voir sa fille vivant au Portugal, elle décédera d'une violente crise d'asthme le 13 février 1558 à Talavera. Eléonore eut une vie peu remplie de joie car même sa fille la rejetait.